細胞復蘇技巧，MDL科研助手來支招

細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個細胞，也可以是細胞系。細胞復蘇是細胞培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，下面小編具體給大家介紹下細胞復蘇的protocal和注意事項！

01、細胞復蘇的原理

細胞復蘇是指將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細胞解凍之后重新培養(yǎng)，細胞恢復生長的過程。當恢復到常溫狀態(tài)時，細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常，生化反即刻恢復。細胞復蘇過程升溫要快，原則是慢凍快融，防止在解凍過程中水分進入細胞，形成冰晶，影響細胞存活。

02、細胞復蘇的實驗步驟

1. 從液氮罐中取出凍存管，置于-80℃冰箱數(shù)分鐘，迅速放入37℃水浴鍋中，不時搖動，使其在2min內(nèi)急速融化，注意不要把凍存管的管口沒入水浴中避免引起污染，復蘇過程中一般細胞死亡率在25%左右；

2. 融化后，凍存管用75％酒精擦拭冷凍管外殺菌后，打開蓋子，取出凍存管的細胞懸液，緩慢加入到有培養(yǎng)液的T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO培養(yǎng)。如果細胞需要去除冷凍保護劑，用移液槍將細胞懸液注入15mL無菌離心管中，

再加5ml培養(yǎng)基，根據(jù)細胞類型選擇合適的離心速度，低速離心5min，棄去上清，加入2-3mL預熱的培養(yǎng)基，輕輕吹勻，保證細胞重懸；

3. 用培養(yǎng)液適當稀釋后，將重懸的細胞接種到培養(yǎng)皿或者T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO培養(yǎng)，24h后，更換新鮮培養(yǎng)基，去除死細胞，三天可進一次換液，當細胞長到有80-90%匯合進行傳代。

03、細胞復蘇的注意事項

1. 取凍存細胞時應做好防護措施，戴好防凍手套，護目鏡。如果凍存管密封不嚴，液氮可被吸入。由于解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，將可能發(fā)生爆炸。

2. 細胞放入水浴中復蘇時注意用鑷子夾住細胞凍存管并在水浴中不時晃動，使其受熱均勻，且速度越快越好，這樣可以最大限度的保存細胞活力，并防止水浴鍋的水進入細胞凍存管造成細胞污染。

3. 打開細胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏?。注意無菌操作，細胞復蘇后的操作在4℃冰盒中進行，以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。

4. 解凍時間在2min以內(nèi)完成，且整個過程盡量避免吹打細胞產(chǎn)生氣泡，導致細胞復蘇后的生長狀態(tài)不佳。

5. 復蘇細胞的時候盡量避免凍存管接縫處沾水，防止支原體污染，實驗室定期用過氧化氫熏蒸，細胞小黑點增多時用支原體檢測試劑盒檢測，并且及時清除。

04、如何避免凍存管爆炸

1.  選擇質(zhì)量好的進口內(nèi)旋凍存管，擰緊蓋子，防止液氮進入管內(nèi)，液氮罐的細胞留種用，平時常用的細胞放在-80冰箱。

2. 凍存細胞時盡量加多一點凍存液，比如2ml凍存管加1.8ml凍存液，保留少量空間。

3. 取細胞時帶好手套和防護眼鏡，準備好鑷子，避免手直接接觸凍存管造成手凍傷或炸傷。

4. 從液氮里取出細胞時，先在液氮罐上面的蒸汽里放一會，然后再拿出來，將凍存盒殘余的液氮流到罐內(nèi)，避免拿出時凍傷，也避免細胞從液氮迅速升到室溫發(fā)生爆炸。