構(gòu)建重組蛋白屢次失敗的原因：分為以下幾點(diǎn)

一、重組蛋白表達(dá)的原理

重組蛋白表達(dá)是利用DNA重組技術(shù)，將目標(biāo)基因（外源基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，并通過(guò)宿主細(xì)胞的生物機(jī)制使其表達(dá)出特定蛋白。其主要步驟包括：

基因克隆：將目標(biāo)基因經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，與表達(dá)載體連接，形成重組質(zhì)粒。

轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，可以使用化學(xué)方法、電穿孔或者嗜熱菌等方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。

表達(dá)蛋白：重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，融合到宿主細(xì)胞的染色體中，隨后遵循細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，表達(dá)出目標(biāo)蛋白。

二、常見(jiàn)的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌是常用的重組蛋白表達(dá)宿主細(xì)胞之一。其優(yōu)點(diǎn)在于生長(zhǎng)快速、易于培養(yǎng)，并且能夠產(chǎn)生大量的蛋白。此外，大腸桿菌的遺傳工具和代謝途徑也被廣泛研究，提供了便利。

酵母表達(dá)系統(tǒng)：酵母表達(dá)系統(tǒng)包括釀酒酵母和畢赤酵母。這些酵母細(xì)胞具有真核細(xì)胞的特點(diǎn)，能夠進(jìn)行正確的蛋白折疊和修飾。同時(shí)，酵母細(xì)胞也可以進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)和高表達(dá)，適用于一些復(fù)雜蛋白的表達(dá)。

昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用于大規(guī)模蛋白表達(dá)。昆蟲(chóng)細(xì)胞具有真核細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，能夠?qū)Φ鞍走M(jìn)行正確的折疊和修飾，適合于表達(dá)大量需求復(fù)雜結(jié)構(gòu)的重組蛋白。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)可用于高效表達(dá)復(fù)雜蛋白和進(jìn)行蛋白質(zhì)研究。哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有真核細(xì)胞特點(diǎn)，能夠進(jìn)行正確的蛋白質(zhì)修飾和折疊，并且在一些特殊情況下需要考慮到人類(lèi)蛋白的免疫原性。

三、重組蛋白生產(chǎn)步驟

細(xì)胞中有兩個(gè)蛋白生產(chǎn)階段：轉(zhuǎn)錄和翻譯，被稱(chēng)為分子生物學(xué)的中心法則。換言之，轉(zhuǎn)錄和翻譯步驟屬于重組蛋白表達(dá)步驟。

為了生產(chǎn)重組蛋白，基因被分離并克隆到表達(dá)載體中。重組蛋白的生產(chǎn)需要蛋白表達(dá)系統(tǒng)、蛋白純化系統(tǒng)和蛋白識(shí)別系統(tǒng)。

獲取重組蛋白的基本步驟：

1.目標(biāo)基因的擴(kuò)增。

2.插入克隆載體。

3.亞克隆到表達(dá)載體中。

4.轉(zhuǎn)化到蛋白表達(dá)宿主中(細(xì)菌(大腸桿菌)、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng))。

5.重組蛋白鑒定試驗(yàn)(Western blot或熒光)

6.大規(guī)模生產(chǎn)。(大規(guī)模發(fā)酵)

7.分離和純化。