1. Freestyle™ 293-F細(xì)胞的培養(yǎng)：在37℃，125rpm，8% CO2的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染當(dāng)天Freestyle™ 293-F細(xì)胞密度達(dá)到1.5-2.5×106個/ml時可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但細(xì)胞存活率需>95%；可以使用生產(chǎn)的臺盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測試劑盒(C0011)進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測。

2. 以50ml懸浮培養(yǎng)的Freestyle™ 293-F細(xì)胞為例，取兩個潔凈無菌離心管，分別加入1.25ml不含抗生素和血清的Freestyle™ 293-F細(xì)胞培養(yǎng)液；然后其中一管加入50μg質(zhì)粒DNA，另一管加入100μl Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑，分別用移液器輕輕吹打混勻，請?zhí)貏e注意不可Vortex或離心。將含有DNA的培養(yǎng)液用槍輕輕加入含Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕顛倒離心管或者用槍輕輕吹打混勻，室溫靜置15分鐘(室溫存放6小時內(nèi)穩(wěn)定)。

轉(zhuǎn)染體系體積10ml20ml50ml100ml200ml500ml

Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑20μl40μl100μl200μl400μl1ml

Freestyle™ 293-F細(xì)胞培養(yǎng)液0.25ml0.5ml1.25ml2.5ml5ml12.5ml

DNA10μg20μg50μg100μg200μg500μg

Freestyle™ 293-F細(xì)胞培養(yǎng)液0.25ml0.5ml1.25ml2.5ml5ml12.5ml

單獨稀釋好的Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑和DNA，混勻并室溫靜止放置15分鐘， 隨后加入到培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，后續(xù)進(jìn)行目的蛋白的檢測和純化。

3. 把2.5ml Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑-DNA混合物全部加入到50ml懸浮培養(yǎng)的Freestyle™ 293-F細(xì)胞中。由于青霉素/鏈霉素雙抗可能影響重組蛋白的表達(dá)，通常不建議在細(xì)胞轉(zhuǎn)染時加入雙抗；如細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境容易發(fā)生污染，可酌情加入1/5常規(guī)用量的雙抗。

4. Freestyle™ 293-F細(xì)胞在37℃，125rpm，8% CO2的搖床培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時后，即可收集細(xì)胞進(jìn)行目的蛋白的檢測和純化。

常見問題：

1. 轉(zhuǎn)染效率低：

a. 優(yōu)化質(zhì)粒與Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑比例，有必要是可以適當(dāng)嘗試加大質(zhì)粒用量。

b. 應(yīng)使用高純度、無菌、無污染物的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，DNA純度方面A260/A280比值要接近1.8通常宜控制在1.8-1.9范圍內(nèi)，偏低則有可能有蛋白污染，偏高則有可能有RNA污染?？梢允褂蒙a(chǎn)的質(zhì)粒大量抽提試劑盒(D0026)進(jìn)行抽提，以保證可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。

c. 需用無抗生素和無血清培養(yǎng)液配制Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的混合物。

d. 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時間不足，而被誤認(rèn)為轉(zhuǎn)染效率偏低。懸浮狀態(tài)下的Freestyle™ 293-F細(xì)胞轉(zhuǎn)染后至顯著表達(dá)所需培養(yǎng)時間通常為48-72小時。

e. 檢查細(xì)胞是否有支原體感染，支原體感染會影響細(xì)胞增殖，并很可能影響轉(zhuǎn)染效率。

f. 如果沒有檢測到目的蛋白表達(dá)，應(yīng)該仔細(xì)核對轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的測序結(jié)果，確保測序結(jié)果和讀碼框正確。

g. 檢查轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度是否過高。

2. 細(xì)胞毒性較明顯：

a. 目的基因的表達(dá)蛋白有毒性。此時可以和空載體轉(zhuǎn)染效果比較，以確定是否是目的基因蛋白表達(dá)對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。如果確定有細(xì)胞毒性，可以考慮適當(dāng)減少質(zhì)粒用量，并按照比例減少Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑。

b. 檢查轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度是否太低。

c. 檢查細(xì)胞是否有支原體等微生物污染。

附錄：

常用多孔板和培養(yǎng)皿的尺寸、培養(yǎng)面積、細(xì)胞培養(yǎng)量和推薦的培養(yǎng)體積等相關(guān)數(shù)據(jù)表：

Multiple Well Plates or DishesSingle Well Only for Plates

Diameter (Bottom, mm)*Growth Area (cm2)*Average Cell YieldTotal Well Volume (ml)Working Volume (ml)Recommended Volume (ml)

6 well34.89.59.5 × 10516.81.9-2.92

12 well22.13.83.8 × 1056.90.76-1.141

24 well15.61.91.9 × 1053.40.38-0.570.5

48 well11.00.959.5 × 1041.60.19-0.2850.25

96 well6.40.323.2 × 1040.360.10-0.200.1

384 well2.70.0565.6 × 1030.1120.025-0.0500.030

1536 well1.63 × 1.63**0.0252.5 × 1030.01250.005-0.0100.010

3.5 cm dish3499.0 × 105NA1.8-2.72

6 cm dish52212.1 × 106NA4.2-6.35

10 cm dish8.4555.5 × 106NA11-16.512

15cm dish141521.5 × 107NA30.4-45.635

24.5cm dish22.4 × 22.4**5005.0 × 107NA100-150120

*Diameter and growth area may vary depending on the manufacturer, and the listed sizes are from Corning.

**These wells or dishes are square.